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原代細(xì)胞培養(yǎng)與操作方法
點(diǎn)擊次數(shù):1911 更新時(shí)間:2021-01-13

原代細(xì)胞的培養(yǎng):

原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。因此,較為嚴(yán)格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養(yǎng),此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì),如果是正常細(xì)胞,仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上,通常把第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。

原代細(xì)胞的培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。

組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上,加入培養(yǎng)基后進(jìn)行培養(yǎng)。

分散細(xì)胞培養(yǎng)大致步驟為:

將動(dòng)物組織從機(jī)體中取出離散成單個(gè)細(xì)胞(常用胰蛋白酶),置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖(注意整個(gè)過(guò)程無(wú)菌)。

原代細(xì)胞操作方法:

(1)取成年新西蘭大白兔,耳緣靜脈注射空氣處死后,取下兔子的雙腿,立即用75%乙醇浸泡。

(2)移入細(xì)胞房?jī)?nèi),去除雙腿表面的皮毛及肌肉,剪取關(guān)節(jié)段,移至超菌工作臺(tái)內(nèi)。

(3)PBS洗滌數(shù)次,用手術(shù)刀或彎剪將關(guān)節(jié)表面的軟骨組織取下。

(4)軟骨組織塊靜置5min,棄去上層液體及懸浮組織,將軟骨組織剪成1mm3的大小。移到離心管中加3倍體積的0.25%胰蛋白酶,置入37℃的恒溫?fù)u床中,振蕩消化15-20min;

(5) 4℃靜置5min;棄上清,PBS洗滌,去上清。加入0.2%膠原酶II,置入37℃的恒溫?fù)u床中,振蕩消化2H;
(6)加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止消化,反復(fù)吹打后依次通過(guò)200目濾網(wǎng)。收集濾液,1200rpm離心8min,棄上清,用DMEM*培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞, 放入37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);

(7)細(xì)胞傳代后放入預(yù)置有薄骨片或蓋玻片的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞*展開后即可固定做原代鑒定。

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