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PCR產物跑不出來條帶原因參考
點擊次數:15080 更新時間:2022-03-23


PCR是分子生物學的常規(guī)和常用手段,用途很多,但是都是通過擴增目的基因片段來實現的。

那么,首先需要搞明白的是,需要擴增的基因片段大小是多大,因為不同大小的基因片段其擴增的難度是有差異的,尤其過長的片段,需要使用不同的taq酶來進行擴增(比如LA taq)。幾點容易發(fā)生問題的地方供參考:

1.引物,PCR是基于引物來實現的。引物是否是自己設計的?如果是,需要檢查一下引物設計的是否合理。如果是從文獻中選取的,一般出問題的可能性不大,不放心的可以在數據庫比對一下,防止文獻出錯。

2.模板,一般來講通過試劑盒提取的DNA質量都是可以保證的,也能在4℃冰箱放置較長的時間,仍能進行PCR擴增。要是通過煮沸法粗提的DNA就沒辦法放置太長時間了。一句話就是,模板DNA的濃度要合適。

3.反應條件,這一塊就比較復雜了,特別是對自己設計的引物來說,選擇合適的退火溫度,是需要慢慢摸索的,一般根據計算的退火溫度降低5~10℃來進行首chi擴增,如果出現了目的條帶,且有雜帶時,在逐步提高退火溫度,以提高反應的特異性。

此外,還有反應體系,電泳條件等等因素。

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